Wstęp

Liposomy, zwane również wesiklami, są to zdyspergowane w wodzie wielowarstwowe układy o niewielkiej objętości zbudowane z biwarstw lipidowych [1, 2].

Gdy bezwodny, suchy film lipidowy zostanie poddany procesowi uwodnienia w połączeniu z mechanicznym mieszaniem, wytrząsaniem to wówczas powstają wielowarstwowe liposomy o średnicy 0.1 – 10 μm (multilamellar vesicles MLV). Znanych jest szereg sposobów pozwalających na przeprowadzenie wielowarstwowych liposomów w mniejsze pęcherzyki, zawierających wciąż pewną objętość wody, otoczoną tylko przez jedną biwarstwę lipidową [3, 4]. Inaczej mówiąc, wielowarstwowa, podobna do cebuli struktura MLV może zostać zastąpiona przez Wielkie Jednowarstwowe Liposomy (Large Unilamellar Vesicles LUV) o średnicy w zakresie 100 – 1000nm albo przez Małe Jednowarstwowe Liposomy (Smali Unilamellar Vescles SUV) o średnicy w zakresie 20 – 50nm albo przez Wielowarstwowe Liposomy o średnicy 500 – 2000nm zawierające w swoim wnętrzu mniejsze liposomy. Liposomy zwykle otrzymywane są z występujących w naturze fosfolipidów takich jak dipalmitoilo fosfatydylocholina (DPPC) lub mogą być otrzymane z niejonowych lipidów (zwane są wtedy niosomami), lipidów niefosfatydylowych, tworząc uporządkowane systemy charakteryzujące się podwyższoną odpornością na działanie środków powierzchniowo czynnych [5, 6], Obecnie prowadzone są prace nad opracowaniem na przykład dendrymerów – jeszcze bardziej wyrafinowanych układów dozujących i doprowadzających substancje aktywne [7]. W poniższych paragrafach przedstawiono kilka sposobów otrzymywania liposomów, metody stosowane do zmieniania i charakteryzowania ich własności transportowych oraz zdolności do uwalniania substancji aktywnych, sposobów na rozrywanie ciągłości struktury biwarstw tworzących ściany liposomów. Oczywiście nie jest możliwe przedstawienie w krótkim opracowaniu wszystkich zagadnień związanych z liposomami, dlatego ograniczono się do autorskiego, subiektywnego przeglądu wybranych najbardziej interesujących zagadnień związanych z liposomami.

Uporządkowane systemy zbudowane ze związków amfifilowych

W 1922 H. Staudinger zaproponował termin „makromolekuły” na określenie produktu reakcji polimeryzacji związków winylowych. W wcześniejszych latach toczyła się żywa dyskusja, czy produkty reakcji związków winylowych tworzą w rzeczywistości związki chemiczne, połączone wiązaniami chemicznymi czy też są to tylko mniej lub bardziej luźno związane agregaty wyjściowych substancji, zawierające ich dimery lub trimery [4]. Na podstawie serii przekonywujących doświadczeń H. Staudinger wykazał, że lepkość wyjściowego roztworu poli(octanu winylu) PVAc oraz lepkość roztworu poli (octanu winylu) otrzymanego po hydrolizie wyjściowego PVAc i ponownej jego estryfikacji są takie same. A zatem wyjściowy PVAc oraz PVAc otrzymany po hydrolizie i estryfikacji są takie same. Czyli inaczej mówiąc mamy do czynienia z tym samym PVAc, o niezmienionym stopniu polimeryzacji i długości łańcucha polimerowego. Czyli jest to prawdziwy związek chemiczny a nie luźno związany agregat z wyjściowego octanu winylu, słabo związanego przez wiązania wodorowe lub dyspersyjne.

Od tego momentu możemy mówić o nowoczesnej nauce o polimerach jako o związkach chemicznych i jednocześnie można obserwować zmniejszenie się zainteresowania koloidami oraz układami wielkocząsteczkowymi związanymi innymi oddziaływaniami niż wiązania chemiczne. W ciągu ostatnich trzydziestu lat ponownie obserwujemy zwiększone zainteresowanie agregatami-układami wielocząsteczkowymi, które nie są związane wewnątrz siebie za pomocą wiązań chemiczych.

Siłą napędową takiego kierunku prac badawczych jest fakt, że fosfolipidowa biwarstwa liposomu jest zbudowana w bardzo podobny sposób do naturalnie występującej błony komórkowej, tworzącej ciekło-mozaikową strukturę ograniczającą pojedyncze komórki, tkanki. Błony komórkowe zbudowane są z substancji amfifilowych – słabo rozpuszczalnych w wodzie związków chemicznych zbudowanych z ugrupowań o charakterze hydrofilowym oraz z ugrupowań o charakterze hydrofobowym. Po przekroczeniu krytycznego stężenia micelarnego (critical micelle concentration CMC) związki amfifilowe tworzą większe agregaty o bardziej uporządkowanej strukturze, takie jak micele, odwrócone micele, biwarstwy, układy tubularne, liposomy. Liposomy zwane również wesiklami zbudowane są z wielowarstwowej, podobnej z budowy do cebuli struktury, zawierającej wewnątrz pewną ilość wody.

Istotnym problemem jest przeprowadzenie takiej struktury MLV w pojedynczą biwarstwę tworzącą liposomy o niewielkim, jednolitym rozmiarze. Jednym ze sposobów na otrzymanie takiego jednolitego rozkładu liposomy jest metoda otrzymywania Wielkich Jednowarstwowych Liposomów LUV Techniką Wytłaczania (Large Unilamellar Vesicles by Extru-sion Techniques LUVET) [2, 8, 9].

Otrzymywanie liposomów techniką LUVET

Podczas mechanicznego wytrząsania w wodzie suchego filmu lipidowego (proces rehydratacji) albo w metodzie inwersji fazowej czyli zastąpienia rozpuszczalnika organicznego przez nierozpuszczalnik, zwykle przez wodę, to powstają zwykle struktury MLV. Aby otrzymać struktury LUV albo SUV charakteryzujące się pojedynczą biwarstwa oraz jednorodnym rozkładem wielkości liposomów, należy rozerwać wielowarstwową membranę tworzącą błony komórkowe liposomów i ponownie utworzyć liposomy ale już z błoną komórkową zbudowaną z pojedynczej biwarstwy. Zwykle efekt ten jest osiągany przez doprowadzenie dodatkowej energii mechanicznej przez działanie ultradźwięków. P.

Cullis zaproponował przetłaczanie wodnej dyspersji liposomów pod niezbyt dużym ciśnieniem dochodzącym do kilku atmosfer przez membranę o ściśle określonym rozmiarze kolumnowych porów. Membrany typu Nuclepore, otrzymane z folii poliwęglan owej i o rozmiarze porów rzędu 400; 200; 100; 50; 30 nm są szczególnie przydatne do tego celu. Po kilkakrotnym przetłoczeniu wodnej dyspersji MLV przez membranę Nuclepore otrzymywana jest dyspersja SUV z względnie niewielkim rozrzutem średnic, odpowiednio 243; 151; 103; 68; 56 nm [2]. Zwykle wystarczy 2 – 4 krotne „przegonienie” dyspersji liposomów przez membranę aby otrzymać względnie jednorodny rozrzut średnic SUV. Zaletą takiego postępowania jest fakt, że w metodzie tej nie są wykorzystywane rozpuszczalniki organiczne, nie jest wymagany proces suszenia i powtórnej rehydratacji. Bez powtarzania procesu zamrażania-rozmrażania (freezethaw process) otrzymuje się liposomy wewnątrz pęcherzyka. Jednolita struktura błony komórkowej pozwala na powtarzalną, zdefiniowaną szybkość uwalniania substancji aktywnej z wnętrza pęcherzyka lipidowego. I jeszcze jedna istotna cecha tego procesu – jest to względnie tani i szybki sposób na otrzymywanie jednorodnych liposomów.

Spolimeryzowane liposomy, środki powierzchniowo czynne zdolne do polimeryzacji

Kluczową rolę w podstawowej własności liposomów, jaką jest ich stabilność oraz szybkość utwalaniania substancji aktywnej, odgrywa skład fosfolipidów tworzących błonę komórkową. Poprzez zastosowanie fosfolipidów zdolnych do polimeryzacji albo środków powierzchniowo czynnych zdolnych do polimeryzacji można wpływać i kształtować stabilność oraz szybkość uwalniania substancji aktywnej przez liposomy. Biwarstwa utworzona ze spolimeryzowanych związków amfifilowych z reguły charakteryzuje się podwyższoną stabilnością – zwiększona odporność na zmiany pH, wpływ temperatury i działanie detergentów. Ale ocena wpływu na szybkość uwalniania substancji aktywnej jest bardziej złożony. Czasem liposomy otrzymane ze spolimeryzowanych fosfolipidów lub spolimeryzowanych substancji powierzchniowo czynnych charakteryzują się zmniejszoną szybkością uwalniania substancji aktywnej a czasem czymś zupełnie przeciwnym – po spolimeryzowaniu biwarstwy obserwuje się wzrost szybkości permeacji. Kilka możliwych przypadków jest dyskutowanych poniżej.

Wiązania nienasycone w hydrofobowej części fosfolipidu

Ugrupowania o charakterze nienasyconym, a zatem zdolne do reakcji polimeryzacji, takie jak grupy winylowe, acetylenowe lub diacetylenowe, mogą znajdować się w jednym albo w dwóch hydrofobowych „ogonach” cząsteczki fosfolipidu [4]. Szczególnie interesujące są własności liposomów utworzonych z ugrupowań diacetylenowych.

Po pierwsze, dzięki sztywnej cząsteczce fosfolipidów zawierających ugrupowania z węglami o hybrydyzacji sp (grupy acetylenowe) powstają względnie trwałe liposomy. Po przeprowadzeniu procesu polimeryzacji (naświetlanie promieniowaniem UV), która jest obserwowana przez zmianę zabarwienia od przezroczystego dla niespolimeryzowanych liposomów poprzez niebieskie i następnie czerwone liposomy powstaje błona komórkowa – biwarstwa – o wysokim stopniu usieciowania. Ponieważ łańcuchy („ogony”) hydrofobowe fosfolipidów tracą swoją elastyczność i mobilność, w znaczny sposób zbliżają się do siebie, to między nimi pojawiają się wolne przestrzenie, otwory. W wyniku tego szybkość uwalniania substancji rozpuszczonych wewnątrz liposomu zwiększa się w porównaniu do szybkości uwalniania z wnętrza niespolimeryzowanych liposomów [10 – 13]. Aby wyeliminować ten niekorzystny rodzaj „skurczu” po reakcji polimeryzacji H. Ringsdorf zaproponował wprowadzenie nienaysonych, zdolnych do polimeryzacji ugrupowań na elastycznym łączniku zwanym spacer [4, 14].

Koncepcja łącznika dla ugrupowań winylowych

W chemii polimerów znanym faktem jest, że grupa me-zogenna albo grupa zdolna do polimeryzacji, aby mogła tworzyć odrębne domeny albo reagować musi posiadać pewną mobilność. Ugrupowane tego rodzaju musi pozostać związane za pomocą elastycznego łącznika, takim rodzajem „smyczy”, z reguły o długości 6 – 8 ugrupowań (CH2). Grupy winylowe a zatem grupy zdolne do polimeryzacji w cząsteczce fosfolipidu mogą być umieszczone jako element wiążący z ugrupowaniem hydrofilowym; jako element wiążący w polimeryzującym ugrupowaniu hydrofilowym lub jako kombinacja obu tych możliwości [4]. Czasem wystarczy do polimeryzowalnego fosfolipidu dodanie niskocząsteczkowego związku winylowego (jak akrylonitryl), który tworzy z nim kopolimer. Powstaje wówczas kopolimer podobny w swym założeniu do koncepcji makromeru (dużocząsteczkowego monomeru zdolnego do polimeryzacji).

Fosfolipid z przeciwjonem o charakterze związku nienasyconego

Interesujące właściwości posiadają liposomy otrzymane z fosfolipidów, w których przeciwjon (czyli ugrupowanie o charakterze kationowym) posiada wiązania nienasycone [4]. Gdy z takiego fosfolipidu powstaną liposomy, po naświetleniu UV zostaną spolimeryzowane przeciw-jony znajdujące się po obu stronach biwarstwy wewnątrz i na zewnątrz biwarstwy tworzącej membranę liposomu. W ten sposób powstaną jakby dwie czasze polimerowe od wewnętrznej i od zewnętrznej strony liposomu. Przed procesem polimeryzacji liposomy mogą zostać poddane procesowi wymiany jonowej. Oczywiście nastąpi ona tylko na zewnątrz liposomu i w ten sposób polimeryzujący przeciwjon w warstwie zewnętrznej biwarstwy może zostać zastąpiony przez niepolimeryzujący przeciwjon. A następnie po naświetleniu promieniowaniem UV polimerowa „czasza” powstanie tylko po wewnętrznej stronie liposomu. Jest jeszcze możliwe zupełnie inne rozwiązanie. Liposomy zostaną utworzone z fosfolipidów nieposiadających przeciwjonów zdolnych do polimeryzacji, przykładowo z DPPC. Następnie w procesie wymiany jonowej w warstwie zewnętrznej membrany liposomu nastąpi zamiana niepolimeryzującego przeciwjonu na przeciwjon ulegający polimeryzacji (zawierający ugrupowanie winylowe). Po naświetleniu promieniowaniem UV powstaną liposomy zawierające jakby czaszę polimerową tylko po zewnętrznej stronie biwarstwy liposomu. Możliwe są jeszcze inne rozwiązania, gdy na przykład w strukturze fosfolipidu umieścimy inne niż winylowe ugrupowania zdolne do reakcji kondensacji, addycji.

Fosfolipidy ze specjalnymi grupami polimeryzującymi

H. Ringsdorf i S. Regen zaproponowali inne niż winylowe ugrupowania do umieszczenia w strukturze fosfolipidu, które umożliwią ich polikondensację lub polimeryzację [15 – 18]. Liposomy tego rodzaju mogą zostać usieciowane przez polikondensację przebiegającą w ugrupowaniu hydrofilowym albo przez reakcję polimeryzacji przebiegającą przez otwarcie pierścienia kwasu lipoikowego umieszczonego na końcu ugrupowań o charakterze hydrofobowym. Ta ostatnia reakcja może zostać uruchomiona przez zmiany pH. W ten sposób można otrzymać liposomy, których szybkość uwalniania substancji aktywnej jest zależna od warunków, w jakich znajdzie się dany liposom. Po zmianie pH startuje reakcja polimeryzacji i zwiększa się szybkość przenikania substancji znajdującej się wewnątrz liposomu. Pomimo tego, że obserwowane wielkości stopnia polimeryzacji nie są zbyt duże (dochodzą do 23), to wzrost szybkości przenikania jest łatwo zauważalny. W ten sposób można otrzymać liposomy, których szybkość dozowania substancji znajdującej się wewnątrz liposomu zależy od warunków otoczenia (np zmian pH). W ten sposób można otrzymać liposomy o kontrolowanym dozowaniu substancji aktywnej znajdującej się wewnątrz liposomu.

Kontrolowane dozowanie aktywnej substancji

Kontrolowane dozowanie substancji aktywnej (Controlled Drug Release) jest główną siłą napędową prac badawczych nad opracowaniem systemu dostarczania substancji aktywnej biochemicznie w określone miejsce i w określonych warunkach. Jedno z możliwych rozwiązań jest związane z wykorzystaniem liposomów.

H. Ringsdorf zaproponował wbudowanie odpowiednich receptorów w zewnętrzną warstwę biwarstwy liposomu [19]. Następnie, dzięki specyficznemu rozpoznaniu komórki rakowej na poziomie molekularnym w wyniku oddziaływania antygen-przeciwciało możliwe jest związanie liposomu z komórką rakową. Jeżeli wówczas będzie miało miejsce uwolnienie substancji aktywnej z wnętrza liposomu może to wywołać zmianę przepuszczalności biwarstwy komórki rakowej i w konsekwencji jej zniszczenie. Zmiana szybkości permeacji może być wywołana przykładowo przez wzrost temperatury. Jeżeli temperatura zbliża się do zakresu przejść fazowych dla błony komórkowej to obserwuje się wówczas wzrost szybkości permeacji [20]. Zmiany temperatury poniżej zakresu przemian fazowych albo podwyższanie powyżej tego zakresu nie powodują wyraźnych zmian szybkości uwalniania substancji rozpuszczonej (karboksyfluoresceiny).

Podobny efekt – zmiana szybkości permeacji pod wpływem zmian pH – została zaobserwowana dla membran enkapsulujących wykonanych z substancji polijonowych [21] lub gdy pod wpływem zmian pH mogła nastąpić polimeryzacja lipidów tworzących liposomy i w konsekwencji zmiana szybkości permeacji [22]. Inną możliwością kształtowania szybkości transportu substancji rozpuszczonej przez liposom jest zapewnienie kontaktu liposomu z odpowiednio zbudowanym supramolekularnym środkiem powierzchniowo czynnym [23]. Interesujące jest, że ten sam środek powierzchniowo czynny, który jest przykładowo skuteczny w zwiększaniu szybkości permeacji substancji niskocząsteczkowej takiej jak karboksyfluoresceina, jest zupełnie nieskuteczny w zwiększaniu szybkości permeacji przez znacznie większe cząsteczki takie jak erytrocyty. Powyższe zjawisko to można tłumaczyć tym, że w wyniku perforacji błony komórkowej liposomu przez supramolekulamy środek powierzchniowo czynny powstają w biwarstwie jakby „okna” o różnym rozmiarze. Rozmiar „okna” może okazać się być dostatecznie duży dla niewielkiej cząsteczki (obserwowany jest wzrost szybkości permeacji) i jednocześnie zbyt mały aby wpłynąć na szybkość permeacji przez substancję wielkocząsteczkową. A zatem różnego rodzaju supramolekukame środki powierzchniowo czynne syntetyzowane „na miarę” (tailor madę) mogą prowadzić do powstania „okien przepuszczalności” o różnym rozmiarze, przez które mogą przenikać (lub nie) cząsteczki o zróżnicowanych rozmiarach.

Ocena własności związków amfifilowych na podstawie charakterystyki ich filmów Langmuira

Amfifilowe związki tworzące liposomy, szczególnie w przypadku błon komórkowych MLV posiadają bardzo złożoną strukturę. Zmienia się ich skład (mieszaniny liposomów), liczba biwarstw w wielowarstwowej strukturze podobnego do cebuli liposomu. Z tego powodu wynika potrzeba charakteryzowania prostszych układów – własności dwuwymiarowego układu zbudowanego z pojedynczej monowarstwy związku amfifilowego (fosfolipidu). Gdy kropla roztworu związku amfifilowego w lotnym rozpuszczalniku organicznym niemieszającym się z wodą zostanie w delikatny sposób umieszczona na powierzchni lustra wody, to nastąpi odparowanie rozpuszczalnika i łagodne rozprowadzenie cząsteczek związku amfifilowego po powierzhni wody. W ten sposób zostanie utworzona monowarstwa ze związku amfifilowego na granicy faz woda-powietrze. Filmy tego rodzaju znane są jako filmy Langmuira i do ich charakteryzowania służy odpowiednio ukształtowana nieckowata przestrzeń, tak zwana waga Langmuira (Langmuir Film Balance). Filmy Langmuira mogą zostać poddane dwuwymiarowej kompresji i w ten sposób mogą zostać scharakteryzowane takie ich własności jak powierzchnia zajmowana przez pojedynczą cząsteczkę, lepkość powierzchniowa monowarstwy, jej stabilność i własności transportowe (przykładowo szybkość parowania wody zabezpieczonej monowarstwa). Monowarstwa fosfolipidowa może zostać sieciowana przez promieniowanie UV, przez reakcję z związkami sieciującymi rozpuszczonymi w subfazie wodnej (glioksal). Zmiana ich struktury może być wizualizowana przez dodanie barwników fluorescencyjnych [24; 25]. Otrzymywane izotermy Langmuira dostarczają istotnych wiadomości o własnościach związków fosfolipidowych.

Wnioski

W ciągu ostatnich 10 lat obserwuje się dwa wyraźne kierunki zmian na rynku wyrobów kosmetycznych i środków czystości. Z jednej strony obserwowane są liczne prace poświęcone liposomom. Powstają coraz bardziej zaawansowane i syntetyzowane „na miarę” systemy transportowe, dostarczające substancje aktywne do komórek skóry lub wyspecyfikowanych tkanek. Przykłady takich modyfikacji były krótko dyskutowane powyżej. Z drugiej strony obserwuje się stały wzrost sprzedaży detalicznej wyrobów kosmetycznych na świecie, w wysokości około 6% rocznie [26]. Istotną część tych wyrobów kosmetycznych stanowią środki do pielęgnacji skóry, środki zabezpieczające przed promieniowaniem słonecznym. Nowe i lepsze środki do pielęgnacji skóry wymagają nowych receptur i składników. Obiecującym składnikiem tych nowych składów i systemów kontrolowanego transportu są liposomy oparte o nowe fosfolipidy lub syntetyczne związki amfifilowe, dendrymery, mikrokapsułkowanie, żele lub polimery o charakterze mezogennym.

Dzięki licznym pracom badawczym poświęconym liposomom, zbudowanych z naturalnych fosfolipidów i syntetycznych amfifili, przypominających naturalne produkty, należy się spodziewać większego ich wykorzystania przy opracowywaniu nowych atrakcyjnych receptur dla środków pielęgnacyjnych i chroniących zdrowie.

Literatura
1.    R.L. Shew, D.W. Deamer, Biochim. Biophysica Acta 816 (1985) 1
2.    L.D. Mayer, M.J. Hope, P.R. Cullis, Biochim. Biophysica Acta 858(1986)161
3.    J. H. Fendler, Chemistry in Britain, 20 (1984) 1098
4.    W. Fabianowski, Polimery XLII, (1997) 1
5.    K. Abate, Soap/Cosmetics/ Chemical Specialties for May, (1993)37
6.    B. Herzog, K. Sommer, W. Baschong, J. Roding, SOFW-Journal 124(1998)614
7.    R. Göller, JP Vors, AM Caminade, JP Majoral, Tetrahedron Letters 42 (2001) 3587
8.    M. Hope, M. Bally, G. Webb, P. Cullis, Biochimica et Biophysica Acta, 812 (1985) 55
9.    R. Nayar, M. Hope, P. Cullis, Biochim. Biophysica Acta, 986 (1989)200    /
10.    G. Roberts, Adv. Phys. 34 (1985) 475
11.    J. Swalen, D. Allara, J. Andrade, E. Chandross, S. Garoff, J. Israelachvili, T. McCarthy, R. Murray, R. Pease, J. Rabolt, K. Wynne, H. Wu, Langmuir 3 (1987) 9
12.    H. Möhwald, Thin Solid Films, 159 (1984) 1
13.    J. Fendler, P. Tundo, Acc. Chem. Res. 17 (1984) 3
14.    H. Ringsdorf, B. Schlarb, J. Venzmer, Angew. Chem. Int. Ed. 27(1988) 113
15.    B. Hupfer, H. Ringsdorf, in „Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers” ed. J. Andrade, Plenum Press (1985) 77
16.    H. Ringsdorf, 35th IUPAC Int. Symp. On Macromolecules, MakroAkron '94, Akron, USA 11-15 VII 1994
17.    A. Sadownik, J. Stefely, S. Regen, J. Amer. Chem. Soc. 108 (1986)7789
18.    D. Bolikal, S. Regen, Macromolecules 17 (1984) 1287