Spektroskopia ramanowska znana jest już od prawie 100 lat ale dopiero w ostatnich latach dzięki rozwojowi mikroelektroniki oraz informatyki stała się coraz szerzej wykorzystywanym narzędziem badawczym w analizie i charakteryzowaniu szeregu produktów, w tym wyrobów kosmetycznych. Główne zalety spektroskopii ramanowskiej polegają na tym, że oznaczenia przeprowadzane są w warunkach otoczenia, nie jest wymagana próżnia ani obecność gazów obojętnych. W oznaczeniach nie przeszkadza obecność wody, przez co spektroskopia ramanowska staje się szczególnie ważnym instrumentem badawczym w preparatach biologicznych, emulsjach typu O/W jak i W/O, kremach. Połączenie z mikroskopem konfokalnym pozwala na przedstawienie trójwymiarowej mapy rozkładu różnych substancji w całej masie badanych próbek z rozdzielczością do 1 –2 mm czyli wykonanie tak zwanego mappingu. Nie jest wymagane żadne wstępne przygotowanie próbki, oznaczenia mogą być wykonywane nawet dla próbek znajdujących się w zamkniętych pojemnikach.

Przedstawione zostaną podstawy spektroskopii ramanowskiej, porównanie z klasyczna spektroskopią IR, trudności związane z fluorescencją próbek i możliwości ich eliminacji przez zmianę długości fali lasera wzbudzającego. Przedstawione zostaną wyniki badania budowy warstw okluzyjnych prowadzone w Wydziale Chemicznym PW, wielowarstwowych laminatów opakowaniowych z wykorzystaniem spektrometru Ramana Nicolet Almega XR.

Wprowadzenie

“Widzę to wierzę” – zdarza się często słyszeć takie stwierdzenie. Rzeczywiście, znakomita większość naszych wrażeń są to wrażenia wzrokowe, ale niestety często są one niewystarczające do pełnego scharakteryzowania własności otaczającego nas świata. I nie ma w tym nic nadzwyczajnego – światło widzialne jest tylko wąskim wycinkiem całego spektrum fal elektromagnetycznych. Fale elektromagnetyczne mogą mieć długości od kilometrów (fale prądu zmiennego), metrów (fale radiowe), od dziesiątek mikrometrów do milimetra (promieniowanie podczerwone IR), 400 – 700nm (promieniowanie widzialne VIS), dziesiątek nm (promieniowanie UV), poniżej 1nm (promieniowanie γ, kosmiczne). Promieniowanie VIS stanowi zatem tylko wąski wycinek fal elektromagnetycznych i budowanie naszej wiedzy o materii i świecie na podstawie tylko tego, co widzimy, to jakby “podglądanie świata” przez dziurkę od klucza. Często chcemy wiedzieć coś więcej, jaki jest skład materiału, budowa krystaliczna, stopień anizotropii i korzystamy wtedy z m.in. z widm pochłaniania (absorpcji) promieniowania IR. Technika zbierania widm IR, wykorzystująca zmiany momentu dipolowego cząsteczek związków chemicznych, wzbogacona techniką Transformacji Fouriera (spektroskopia FTIR) i różnymi technikami specjalnymi (Attenuated Total Reflection ATR, Grazing Angle GA, Variable Angle VA, Diffusive Reflectance DR) jest szeroko znana i stosowana w chemii i fizyce. Posiada jednak pewne ograniczenia, na przykład cząsteczki nie wykazujące zmian momentu dipolowego są w IR “niewidoczne”. Teoria fal elektromagnetycznych przewidywała2,3 że w wyniku procesu rozpraszania światła przez cząsteczki, na które pada promieniowanie o długości fali świetlnej n0, powinno pojawiać się emitowane promieniowanie o niezmienionej długości fali świetlnej n0 (promieniowanie Rayleigha) oraz promieniowanie o dłuższej długości fali czyli o mniejszej wartości częstotliwości drgań n0 - n (promieniowanie stokesowskie) oraz promieniowanie o krótszej długości fali czyli o większej wartości częstotliwości drgań n0 + n (promieniowanie antystokesowskie). W 1928 roku indyjski profesor fizyki z Uniwersytetu w Kalkucie Sir Chandrasekhara Venata Raman potwierdził te oczekiwania odkrywając dla benzenu kombinacyjne rozpraszanie światła. Już dwa lata później w 1930 roku za odkrycie “zjawiska Ramana” został nagrodzony Nagrodą Nobla. Na Rys. 1 przedstawiono zasadę powstawania widm dyspersyjnych ramanowskich zawierających promieniowanie o niezmienionej długości fali (promieniowanie Rayleigha), promieniowanie o mniejszej częstotliwości (stokesowskie) oraz promieniowanie o wyższej wartości częstotliwości (antystokesowskie).

Jednak emisyjne widma ramanowskie w praktyce eksperymentatorskiej okazały się wyjątkowo trudne do otrzymania. Natężenie pasm stokesowskich stanowi około 10-3 natężenie światła rozproszonego o niezmienionej długości fali (promieniowanie Rayleigha) a natężenie promieniowania antystokesowskiego wynosi odpowiednio około 10-6. Oczywiście można zwiększyć te natężenia zwiększając moc dawki światła wzbudzającego, ale prowadzi to szybko do zniszczenia próbki, zwłaszcza organicznej, gdy pada na nią zbyt duża ilość energii świetlnej. Do lat 80-tych poprzedniego stulecia problem był nie do rozwiązania, ale wraz z rozwojem mikroelektroniki, informatyki obserwujemy od tego czasu niezwykły rozwój “starych”, teoretycznie opracowanych procedur z wykorzystaniem nowych możliwości aparaturowych zarówno sprzętowych (hardware – lasery, czujniki) jaki i informatycznych (software). Dotyczy to licznych technik pomiarowych – takich jak FTIR, pomiarów rozpraszania światła oraz spektroskopii ramanowskiej. Laserowa spektroskopia ramanowska posiada szereg zalet, które zostaną poniżej krótko omówione.

2. Zalety i wady dyspersyjnej spektrometrii ramanowskiej z mikroskopem

Widma spektralne ramanowskie zbierane w świetle emitowanym w wyniku rozpraszania światła przez próbkę, na którą pada wzbudzające światło laserowe są cennym uzupełnieniem absorpcyjnych widm zbieranych w zakresie IR. Jest to uzupełnienie komplementarne, to znaczy, że nie jest to powtórzenie, inna metoda zbierania tych samych danych, ale obowiązuje tutaj reguła wzajemnego wykluczania (zakaz alternatywny)2. Drgania aktywne w spektroskopii IR są nieaktywne w widmie Ramana i na odwrót, silne pasma w widmie ramanowskim nie są obecne w widmie IR. Dzięki temu takie cząsteczki jak CO2, wiązania C=C nieobecne w widmie IR są widoczne w widmie Ramana. Pasma absorpcji pochodzące od cząsteczek wody, bardzo silne w widmie IR i prowadzące do praktycznie niemożności badania związków zawierających dużą ilość wody są niewidoczne w widmach ramanowskich, obecność wody dla tych widm nie stanowi przeszkody. A zatem możliwe staje się oglądanie i zbieranie widm preparatów biologicznych, tkanek oraz co jest dla nas szczególnie istotne – kremów, emulsji, czyli substancji zawierających dużą ilość wody. Jest to wielka zaleta spektroskopii ramanowskiej, że może “wejść” na obszary niedostępne dla innych technik IR a istotne do badań produktów biochemicznych, farmaceutycznych i kosmetycznych. Na Rys. 2 dokonano krótkiego porównania widm absorpcyjnych IR i widm dyspersyjnych Ramana.

Kolejna zaleta widm ramanowskich jest związana z możliwością mappingu. Mapping polega na skanowaniu wybranego obszaru próbki, podobnie jak to ma miejsce przy generowaniu obrazu w mikroskopii SEM czy w obrazie TV, ale w wyniku tego skanowania powstaje nie obraz do oglądania, ale widmo spektroskopowe, wykazujące obecność/nieobecność pewnych ugrupowań a co za tym idzie obecność/nieobecność pewnych związków chemicznych, w których te ugrupowania mogą być obecne. Jest to istotne wzbogacenie naszej wiedzy o badanym preparacie – możemy nie tylko zobaczyć, jaka jest jego struktura czy tekstura, ale dodatkowo można przypisać poszczególnym fragmentom obrazu ich skład chemiczny.

Takie mapowanie dwuwymiarowe (XY mapping) może być prowadzone z rozdzielczością do 1 mm. Ale to nie wszystkie zalety połączenia dyspersyjnego spektrometru ramanowskiego z mikroskopem. Dzięki wprowadzeniu mikroskopii konfokalnej, podobnie jak to ma miejsce w zbieraniu obrazu konfokalnego, można widzieć przekroje poprzeczne wybranych fragmentów preparatu – na przykład przekrój poprzeczny przez komórkę kolejnych warstw oddzielonych od siebie o 1-2 mm. W spektrometrze dyspersyjnym ramanowskim z mikroskopem konfokalnym też dokonywane są takie przekroje poprzeczne z rozdzielczością do 1-2 mm, ale zbierane są informacje o składzie kolejnych warstw a nie ich wyglądzie. W ten sposób informacja “co widać” może zostać wzbogacona o informacje “co to jest” – jakie pasma są obecne, jakie pasma są nieobecne i co za tym idzie, jakie grupy lub związki chemiczne są obecne lub nieobecne w danym punkcie przestrzennym preparatu. A zatem może być dokonywane mapowanie trójwymiarowe XYZ sięgające w głąb materiału nawet na głębokość kilkudziesięciu mm.

Zbieranie widm ramanowskich nie wymaga szczególnego przygotowania próbek, mogą być zbierane widma dla takich próbek jakie są i to wszystko w atmosferze otoczenia. Nie jest wymagana wysoka próżnia, atmosfera bezwodna lub gazu obojętnego, nie ma ruchomych części (pompy, zasuwy, zawory), przepływu gazów ani uszczelek, które są czasem tak dokuczliwe w innych aparatach badawczych. Dzięki mikroskopii konfokalnej i długoogniskowym obiektywom można zbierać widma nawet z substancji znajdujących się w zamkniętych fiolkach, buteleczkach czy pojemnikach bez ich otwierania.

Oczywiście spektroskopia dyspersyjna ramanowska nawet połączona z mikroskopem ma swoje ograniczenia. Do podstawowych należy fluorescencja, gdy na światło emitowane z próbki w wyniku rozpraszania nakłada się intensywne światło fluorescencyjne zakłócające zbierane widmo. Są pewne możliwości uniknięcia fluorescencji – na przykład wykorzystując fakt, że emisja promieniowania rozproszonego następuje w czasie pikosekundowym a emisja fluorescencji z pewnym opóźnieniem, bo w czasie nanosekundowym od momentu naświetlenia próbki. Stosując odpowiednią sekwencje czasową wzbudzania światłem laserowym, zbierania widma i zamykania zbierania widma (odcinania fluorescencji) można rozwiązać ten problem. Częściej spotykanym rozwiązaniem jest zastosowanie lasera wzbudzającego o innej długości fali.
W ten sposób fluorescencja, która jest obecna przy pewnej długości fali światła lasera wzbudzającego może przy innej długości fali wzbudzającej (drugi laser) nie pojawić się.

Pewną trudność w zbieraniu widm ramanowskich jest niska intensywność interesującego nas promieniowania rozproszonego. Co prawda znana jest technika SERS (Surface-Enhanced Raman Scattering), która wykorzystuje znacznie lepszą jakość widm ramanowskich zbieranych z szorstkich powierzchni zwykle elektrod Ag wstępnie poddanych elektrochemicznej obróbce w cyklach utleniania/redukcji (Cyclic Voltammetry). Zastosowanie koloidów srebrnych albo szklanych kuleczek z zwierciadełkami Au jest interesującą szansą na wykorzystanie efektu SERS do badania na przykład preparatów biologicznych lub kosmetycznych (emulsje, kremy, warstwy okluzyjne).

Inną trudnością z zbieraniem widm ramanowskich jest wciąż dość wysoka cena dyspersyjnych spektrometrów ramanowskich z mikroskopem.

3. Przykłady zastosowań dyspersyjnej spektroskopii ramanowskiej w badaniach kosmetycznych

Przedstawione zostaną przykłady zastosowania dyspersyjnej spektroskopii ramanowskiej do badania typowych wyrobów kosmetycznych takich jak szampony i żele oraz maści i kremy. Obserwując pod mikroskopem optycznym warstwę szamponu czy żelu -preparatu do kąpieli czy też obserwując warstwę kremu w pudełeczku widać, że nie jest to materiał jednorodny ale o rozwiniętej teksturze, że występują w nim domeny o innym zabarwieniu, wyglądzie i co za tym idzie, prawdopodobnie o innym składzie. Dyspersyjny spektrometr ramanowski z mikroskopem pozwala na wybranie na powierzchni badanego preparatu interesującego nas punktu (na przykład “ciemna grudka” i “jasna grudka” w kremie) albo wyznaczenie pewnej linii albo całego obszaru powierzchni i następnie zeskanowanie go, czyli wykonanie mapy spektralnej całego wybranego obszaru. Następnie korzystając z naszej wiedzy (jakie składniki są obecne w danym preparacie) lub korzystając z biblioteki widm (dla nieznanego preparatu) można dokonać przypisania całemu badanemu obszarowi odpowiedniego składu. A zatem możliwe jest nie tylko ocenienie, co znajduje się w danej mieszaninie, ale też w jakim stopniu jest wymieszane, w jakich proporcjach. Takie mapowanie XY może zostać rozszerzone na “sięgnięcie” w głąb próbki i dokonanie identycznych operacji mapowania trójwymiarowego XYZ. Taka operacja może być przeprowadzona nie tylko dla gotowego produktu, ale też dla produktu po nałożeniu na skórę, wysuszeniu czyli na przykład do badania struktury warstw okluzyjnych powstałych po nałożeniu kremu czy emulsji. Na Rys. 3 przedstawiono skład różnych składników, które zostały rozpoznane w mieszaninie znajdującej się w tabletce medycznej.

Dodatkową zaletą dyspersyjnego spektrometru ramanowskiego z mikroskopem jest możliwość pracy z włóknem optycznym do transmisji danych i w ten sposób badana próbka nie musi ograniczać się tylko do preparatu mieszczącego się na stoliku mikroskopu. Może być to dowolnie duży obiekt, przykładowo można zbierać widma ramanowskie z powierzchni skóry probanta bezpośrednio po nałożeniu kremu.

Produkty kosmetyczne to nie tylko sam preparat kosmetyczny, to również opakowanie, jego wygląd i budowa fizykochemiczna. Ten aspekt produktów kosmetycznych ma szczególne znaczenie, bo często nabywca nie ma innej możliwości oceny produktu jak tylko naklejka i wygląd samego opakowania. Dyspersyjny spektrometr ramanowski z mikroskopem jest nieoceniony do badania wielowarstwowych laminatów lub dodatków do tworzyw sztucznych (na przykład nadających mu “miękki chwyt” – efekt soft touch). Laminaty wielowarstwowe mogą być badane metodą trójwymiarowego mappingu XYZ bez rozdzielania na poszczególne warstwy albo mogą być też badane składy poszczególnych warstw na przekrojach poprzecznych. Zakładając wielkość kroku – odległości, w których zbierane są poszczególne widma na przykład na 1 mm lub nawet na ułamek mm, można zebrać widma z przekroju wielowarstwowego laminatu i znaleźć odpowiedź, czy w jego skład weszła tylko jedna lub też trzy folie (PA-PE-PA) czy też dodatkowo dwie folie przekładkowe-łączące (PA-warstwa klejowa-PE-warstwa klejowa-PA) czy wręcz mieliśmy do czynienia z laminatem siedmiowarstwowym. Możliwości spektroskopii ramanowskiej z mikroskopem wydają się być pod tym względem nieocenione.

Dyspersyjna spektroskopia ramanowska znajduje już zastosowanie do analizy składu kamieni nerkowych, badania tkanek, dozowania leków, dyfuzji i wnikania rozpuszczalników w głąb substancji stałych-polimerów lub skóry, białek, DNA, wirusów, biomateriałów. Należy sądzić, że jesteśmy wciąż na początku odkrywania możliwości dyspersyjnej spektroskopii ramanowskiej połączonej z mikroskopem konfokalnym.

4. Wnioski

Dzięki rozwojowi techniki w ostatnim dwudziestopięcioleciu niektóre znane techniki badawcze uzyskały nowe możliwości i stały się szeroko dostępne. Szczególne zalety wykazuje spektroskopia dyspersyjna ramanowska posiadająca możliwość badania produktów kosmetycznych w warunkach naturalnych, w obecności wody i atmosfery. Technika ta pozwala nie tylko “zobaczyć” badany wyrób ale też zidentyfikować jego składniki.