W celu ograniczenia do minimum testów na zwierzętach, konieczny jest rozwój modeli in vitro, bazujących na rekonstrukcji ludzkiego naskórka. Dlatego też, zdecydowano się na przeprowadzenie badań z użyciem mikromacierzy DNA, które mogą przyczynić sie do rozwoju alternatywnych wobec testów na zwierzętach metod oceny działania drażniącego kosmetyków.
Dotychczas stosowane, testy Draize'a (Draize rabbit skin irritancy tests) straciły na popularności, gdy w 2004 roku dyrektywa Rady Europejskiej ograniczyła sprzedaż produktów, których składniki testowano na zwierzętach.
W związku z tym, wzrosło zapotrzebowanie na modele ludzkiego naskórka in vitro, które pozwolą zastąpić testy na zwierzętach. Jednym z nich jest test EpiSkinTM (SkinEthic Laboratories, Nice, France). W teście tym, używa się dojrzałych ludzkich keratynocytów na kolagenowym podłożu, hodowanych w warunkach umożliwiających pełną dyferencjację i odtworzenie poszczególnych warstw naskórka.
Nowy model LabCyteTM EPI-MODEL (LabCyte), odwzorowujący warstwy naskórka w podobny sposób co EpiSkinTM, jest obecnie komercyjnie dostępny w Japonii.
Rys. Porównanie struktur ludzkiej skóry z LabCyte EPI-MODEL
Jego możliwości diagnostyczne zostały rozszerzone, dzięki opracowanej ostatnio mikromacierzy DNA Genopal, niosącej geny odpowiedzialne za procesy zapalne, odporność i stres.
W celu oceny przydatności w/w macierzy do określenia stopnia podrażnienia w modelach in vitro, sprawdzono poziom ekspresji genów, indukowanych w odpowiedzi na aplikację delikatnego środka drażniącego - SDS (siarczek dodecylanu sodu) na model LabCyteTM EPI-MODEL. SDS zastosowano w stężeniu od 0.05 do 0.075%, a czas ekspozycji wynosił 18h.
Podrażnienie określono na podstawie zmian w ekspresji, uwzględnionych w macierzy genów, odpowiadających m.in. za procesy zapalne, odporność czy stres. Uzyskane wyniki potwierdzono metodą RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction). Dodatkowo, sprawdzono sekrecję IL-1α do medium hodowlanego metodą ELISA i wykonano test MTT w celu oceny cytotoksyczności.
Badania wykazały, że ekspresja 10 z 205 genów uwzględnionych na mikromacierzy uległa istotnej zmianie po zastosowaniu SDS w stężeniu od 0.05% do 0.075%. Wśród genów tych znalazły się m.in. antagonista receptora interleukiny-1 (IL-1RN), antygen z grupy FOS (FOSL1), białko szoku cieplnego HSPA1, gen MYD88, a także dobrze poznane markery podrażnień IL-1β i IL-8. Ponadto, potwierdzono obecność IL-1α w medium po zastosowaniu najwyższego stężenia SDS.
IL-1α i IL-1β są ważnymi przekaźnikami odpowiedzi na stan zapalny i odgrywają kluczową rolę w stanach zapalnych skóry. Interleukina IL -1α jest uwalniana do przestrzeni międzykomórkowej na skutek uszkodzeń czy infekcji naskórka.
Geny IL -1RN z rodziny cytokin IL -1 hamują aktywność IL-1α i IL-1β i wpływają na wiele genów z rodziny IL-1 odpowiedzialnych za odporność i odpowiedź przeciwzapalną.
IL –8 jest również znanym mediatorem w stanach zapalnych, badania za pomocą mikromacierzy wykazały wzrost ekspresji także i tego genu. Ponadto wykazano, że na skutek działania rożnych środków drażniących geny IL-1α i IL-8 charakteryzowały różne profile odpowiedzi.
HASP1 jest głównym białkiem szoku cieplnego w ludzkim naskórku. Badania wykazały, że HSPA1, a także inne geny białek szoku cieplnego (FOSL1 czy JUNB) są aktywowane na skutek drażniącego działania SDS.
Podsumowując, badania za pomocą mikromacierzy, potwierdziły wzrost ekspresji genów związanych z podrażnieniem w wyniku zastosowania SDS w zrekonstruowanym modelu ludzkiego naskórka LabCyte. Ponadto, dzięki zastosowaniu mikromacierzy wraz z techniką RT PCR, po raz pierwszy wykazano indukcję ekspresji genów IL –1RN, MYD88, FOSL1 i HASP1 w odpowiedzi na podrażnienie bez ich negatywnego wpływu na żywotność modelu.
Tym samym, możemy stwierdzić, iż mikromacierze są użytecznym i wystarczająco czułym narzędziem do oceny łągodnego działania drażniącego in vitro, któremu nie towarzyszy cytotoksyczność.
Oprac. Emilia Witkowska
Źródło: Niwa M., Nagai K., Oike H., Kobori M. Evaluation of the Skin Irritation Using a DNA Microarray on a Reconstructed Human Epidermal Model. Biol. Pharm. Bull. 32(2) 203—208 (2009), Feb, 2009
Zdjęcie: Japan Tissue Engineering Co., Ltd.
Zobacz także:
AKTUALNOŚCI:
Ocena genotoksyczności kosmetyków in vitro z wykorzystaniem EpiDerm™
ECVAM zatwierdziło dwie kolejne metody do oceny działania drażniącego in vitro
ARTYKUŁY:
KOSMETOLOGIA: Niepożądane działania kosmetyków i metody ich badania
